發(fā)布時(shí)間：2017-05-03
2017年5月2日，《Journal of Cell Biology》期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為《視網(wǎng)膜成體干細胞胚胎起源雙潛能細胞》的研究論文，該研究由中科院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心何杰研究組完成。該研究采用基于彩虹魚(yú)克隆分析，在單細胞水平上揭示了視網(wǎng)膜干細胞在視網(wǎng)膜睫狀邊緣區的準確定位；同時(shí)在邊緣區中發(fā)現一類(lèi)目前尚未報道的靜息態(tài)細胞。此外，此研究采用原位細胞譜系追蹤，闡述了視網(wǎng)膜干細胞胚胎發(fā)育的精確細胞譜系，從而揭示視網(wǎng)膜干細胞起源于視泡 (optic vesicle)中間層上皮細胞中的一群雙潛能細胞。此項工作發(fā)現了視網(wǎng)膜干細胞發(fā)育的細胞譜系基礎，為進(jìn)一步的視網(wǎng)膜干細胞發(fā)育的分子機制，最終實(shí)現視網(wǎng)膜干細胞微環(huán)境的體外重建提供重要的實(shí)驗依據。
在低等脊椎動(dòng)物中，視網(wǎng)膜干細胞位于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區中。在低等脊椎動(dòng)物一生中，例如斑馬魚(yú)，視網(wǎng)膜能夠不斷增大。整個(gè)終生的視網(wǎng)膜生長(cháng)就是通過(guò)視網(wǎng)膜干細胞的增殖和分化而實(shí)現的。在進(jìn)化的過(guò)程中，更高等的脊椎動(dòng)物，視網(wǎng)膜睫狀邊緣區細胞產(chǎn)生各種視網(wǎng)膜神經(jīng)元的能力會(huì )更越弱。但是越來(lái)越多的證據表明，在哺乳動(dòng)物中，視網(wǎng)膜睫狀邊緣區細胞仍然具備產(chǎn)生新的神經(jīng)元的潛能，只是在體內的環(huán)境中，這些潛能被沉默了。其原因目前尚不清晰，這也是神經(jīng)發(fā)育和再生領(lǐng)域一個(gè)重大命題。因此，更好地了解低等動(dòng)物視網(wǎng)膜干細胞的微環(huán)境及其胚胎起源，將更有助于我們了解高等脊椎動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜干細胞沉默的原因，為尋找激活這些干細胞的方法提供重要實(shí)驗依據。
在以往以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物研究視網(wǎng)膜發(fā)育的過(guò)程中，發(fā)現眼柄通過(guò)外翻發(fā)育成具有中間上皮細胞和外側上皮細胞的視泡結構，視泡中的中間上皮細胞通過(guò)遷移進(jìn)入外側上皮細胞，逐漸發(fā)育為視杯結構，而視網(wǎng)膜的干細胞就是來(lái)源于這群視泡中間上皮細胞。但是對于視網(wǎng)膜干細胞在視網(wǎng)膜中的具體定位以及胚胎視網(wǎng)膜前體細胞發(fā)育為視網(wǎng)膜干細胞的精確細胞譜系模式尚不清楚。
研究團隊以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物，采用基于彩虹魚(yú)的克隆分析，將視網(wǎng)膜干細胞精確定位于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區最外周第二層或第三層細胞。相對于視網(wǎng)膜睫狀邊緣區中其他視網(wǎng)膜前體細胞，視網(wǎng)膜干細胞的細胞周期比較長(cháng)。此外，研究團隊還發(fā)現視網(wǎng)膜睫狀邊緣區最外周第一層細胞是一類(lèi)完全處于靜息狀態(tài)的新細胞類(lèi)型。RNA原位雜交實(shí)驗表明，它們既不表達視網(wǎng)膜干細胞的分子標記，也不表達或者僅微弱表達視網(wǎng)膜色素細胞相關(guān)的分子標記。關(guān)于這類(lèi)新的細胞對于視網(wǎng)膜干細胞的維持的作用還需要進(jìn)一步的研究。
在準確定位視網(wǎng)膜干細胞的基礎上，研究人員進(jìn)一步尋找視網(wǎng)膜干細胞的胚胎起源。Kaede是一種光轉化蛋白，在405nm激光照射下，能夠由綠色變?yōu)榧t色。將核定位光轉化蛋白nls-kaede的mRNA注射到野生型斑馬魚(yú)的胚胎中。在視網(wǎng)膜發(fā)育的視泡階段，對表達Kaede蛋白的視泡中間上皮細胞進(jìn)行單細胞光轉化，通過(guò)分析由單個(gè)上皮細胞衍生的克隆，研究人員發(fā)現：視網(wǎng)膜干細胞只能由視泡中間上皮細胞中一群雙潛能細胞產(chǎn)生；這群雙潛能細胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜干細胞的同時(shí)產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素細胞，是一群細胞周期比較短的細胞。RNA原位雜交實(shí)驗表明，這群雙潛能細胞既表達視網(wǎng)膜干細胞的分子標記，也表達視網(wǎng)膜色素細胞的標記。而視網(wǎng)膜視泡中間上皮細胞中的其他細胞則只能產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素細胞或者視網(wǎng)膜前體細胞。
此工作在單細胞水平上揭示了視網(wǎng)膜睫狀邊緣區微環(huán)境中的細胞類(lèi)型組成及其特征，為深入探究視網(wǎng)膜干細胞微環(huán)境的穩態(tài)維持提供了實(shí)驗基礎。此外，雙潛能細胞的發(fā)現為深入研究視網(wǎng)膜干細胞胚胎發(fā)育的分子機制提供了細胞譜系基礎，為最終理解視網(wǎng)膜干細胞的產(chǎn)生和維持機制提供可能。
此項工作由助理研究員湯霞和實(shí)習生高嘉男在何杰研究員的指導下完成；課題組的賈新玲協(xié)助完成了重要的RNA原位雜交實(shí)驗；研究期間項目還得到了健康所潘巍峻研究團隊的協(xié)助。
在斑馬魚(yú)出生后18小時(shí)到26小時(shí)這段期間，視泡中間上皮細胞層的快速分裂的雙潛能細胞（BP，藍色）遷移進(jìn)入外側上皮細胞層，在這個(gè)過(guò)程中雙潛能細胞增殖產(chǎn)生一個(gè)視網(wǎng)膜色素上皮細胞的前體細胞（PP， 黑色） 和一個(gè)視網(wǎng)膜干細胞的前體細胞（SP，紅色）。隨后視網(wǎng)膜干細胞的前體細胞（SP，紅色）表現出較長(cháng)的細胞周期，并通過(guò)細胞分裂產(chǎn)生三種類(lèi)型的細胞譜系模式：一種為非対稱(chēng)分裂產(chǎn)生一個(gè)視網(wǎng)膜干細胞（S，紅色） 和一個(gè)CMZ尖端靜息態(tài)細胞 （D；黑色/紅色；占RSC產(chǎn)生的細胞譜系的60%）；第二種為非対稱(chēng)分裂產(chǎn)生一個(gè)視網(wǎng)膜干細胞RSC（S，紅色）和一個(gè)視網(wǎng)膜前體細胞（RP，紅色；占RSC產(chǎn)生的細胞譜系的38%）；第三種為對稱(chēng)分裂產(chǎn)生兩個(gè)視網(wǎng)膜干細胞（S，紅色；占RSC產(chǎn)生的細胞譜系的2%）。與此同時(shí)，視網(wǎng)膜色素上皮細胞前體細胞（PP，黑色）通過(guò)增殖分裂產(chǎn)生兩種類(lèi)型的細胞譜系：一種細胞譜系包括兩個(gè)視網(wǎng)膜色素細胞（P；黑色，64%）；另外一種細胞譜系包括一個(gè)視網(wǎng)膜色素細胞（P，黑色）和一個(gè)CMZ尖端靜息態(tài)細胞（D，黑色/紅色；36 %）。CMZ尖端靜息態(tài)細胞（D，黑色/紅色）既可以由視網(wǎng)膜色素上皮細胞前體細胞（PP, 黑色）產(chǎn)生，也可以由視網(wǎng)膜干細胞前體細胞（SP，紅色）產(chǎn)生。
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